骨肉瘤是兒童和青少年中最常見的骨癌類型，據估計，局部疾病患者的骨肉瘤死亡率為23%，癌症轉移患者的死亡率高達74%。cfDNA作為一種重要的非侵入的癌症診斷標誌物，越來越多的研究顯示癌細胞釋放的cfDNA具有獨特的非遺傳特性，其中就包含cfDNA片段的大小分佈。最近，cfDNA片段的全基因組分析也表明cfDNA在不同類型的癌症中是具有獨特的片段大小，其中對乳腺癌、結直腸癌、胃癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌的檢測具有>90%的高靈敏度以及98%的高特異性，此外，cfDNA片段的大小已被認為是多種癌症的預估標誌物以及低於167bp的短片段與晚期胰腺癌、乳腺癌和腎細胞癌患者的預後差有關。而對於骨肉瘤cfDNA片段的分析研究卻很少。

泰國清邁大學醫學院肌肉骨骼科學與轉化研究中心的專家團隊^[1]對骨肉瘤患者cfDNA的大小分佈特徵進行了研究，通過對比骨肉瘤患者和健康對照者cfDNA片段大小分佈來評估骨肉瘤患者的診斷和預後價值，開發了一種新的更具吸引力的檢測cfDNA片段分佈的方法，即採用QIAGEN的QIAxcel全自動毛細管電泳系統搭配QIAxcel DNA High Resolution Kit來完成。研究中，提取了65例(15例健康者+50例骨肉瘤患者)血漿樣本的cfDNA（QIAGEN的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit），並利用QIAxcel系統分析cfDNA片段大小分佈與濃度水準。此外，還通過對相對應的cfDNA和骨肉瘤組織樣本進行全基因組定序，研究cfDNA的大小和突變之間的相關性，以及cfDNA與相對應的組織腫瘤之間的突變一致性。

研究結果表明：骨肉瘤患者cfDNA片段的大小明顯短於健康者，通過對cfDNA大小分佈和濃度水準的綜合分析可使診斷效率的特異性和靈敏性提高到100%（圖1）。短cfDNA片段(150bp)是該骨肉瘤序列的獨立的預後標記物（圖2）。變短的cfDNA片段被發現是突變的主要來源。小於或等於150bp的cfDNA片段，與總cfDNA相比，拷貝數變異信號的檢測可顯著提高2.3倍，與匹配的骨肉瘤組織具有更高的一致性。這一發現同時證明了cfDNA大小譜在預後不良骨肉瘤患者分層中的潛力以及cfDNA的短片段是促進骨肉瘤顯著突變檢測的一個有希望的標記物。全自動毛細管電泳測定cfDNA的結果與全基因組定序結果高度一致，進一步驗證了QIAxcel系統可準確地鑒定cfDNA大小分佈，具有精確度高、通量高以及成本效益高等優勢。

圖2.  A：cfDNA片段亞峰的分佈圖；Kaplan Meier曲線顯示總生存率為(B) cfDNA片段大小和(C) cfDNA濃度水準的特徵；D：cfDNA峰值為150bp與>150bp患者cfDNA濃度水準的比較；E：圖示採用全自動毛細管電泳技術對cfDNA片段大小分佈進行分析，用於骨肉瘤的診斷和預後。

QIAxcel Connect全自動核酸分析系統

QIAxcel Connect全自動核酸分析系統只需採用即用型預製凝膠卡夾，最快3分鐘即可完成12個樣品的分析，每次運行可分析多達96個樣品。該系統無需額外螢光檢測分析設備從而可大大降低運行成本提高工作效率。QIAxcel DNA High Resolution Kit可快速分析樣品，在低於0.5kb片段範圍內可獲得3-5bp的差異檢出，適合高解析度基因分型VNTR、STR等應用。QIAxcel DNA High sensitivity Kit可達到最低5pg/μl核酸的檢出，適合游離核酸等極低濃度樣本的檢測。

圖2: QIAxcel的預制卡夾

QIAxcel® Connect 全自動毛細管電泳儀—高通量、高效益、高精准

QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit

高品質cfDNA是成功的第一步-

QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit基於QIAGEN經矽膠膜法純取方案，搭配QIAvac 24真空底座系統，可同時快速處理24份起始體積高達5ml的血清、血漿等體液樣本，最低僅需20μl elution體積，更好適用於具有高靈敏度要求的cfDNA應用。

EZ1＆2 ccfDNA Kit+EZ2 Connect

全自動8ml大體積cfDNA純化方案- 

EZ1&2 ccfDNA Kit利用磁珠法純取技術配合EZ2 Connect全自動核酸純化儀，每次可完成1-24份大體積的血清、血漿、胸腔積液等體液樣本的高效自動化、標準化純化。處理體積可靈活選擇1-8ml，快速（35-70分鐘）獲得高品質cfDNA，可以保障下游檢測應用結果的高準確度、高重複性以及高靈敏度，適合cfDNA相關應用。另外，EZ2 Connect移液系統配備帶濾芯的吸頭，有效避免氣溶膠污染，更有嵌入式LED長壽命紫外燈，伴隨自動加樣臂的移動，紫外燈可無死角照射儀器內部各個角落，保證杜絕交叉污染。

圖3. 高靈敏地分析cfDNA 用EZ1&2™ ccfDNA試劑盒純取EDTA采血管中8ml cfDNA，濃度為0.924ng/μL (Qubit dsDNA HS Assay Kit)，經QIAxcel Connect分析可區分單核小體、雙核小體和三核小體峰以及峰的大小

1. Sasimol Udomruk，et al. (2023) Characterization of Cell-Free DNA Size Distribution in Osteosarcoma Patients. Clinical Cancer Research.