RNA萃取攻略EP4
研究基因的表達和調控時需要從組織和細胞中分離和純化RNA，完整且無雜質的RNA是RT-qPCR、Northern Blot和二代定序 (NGS) 等下游基因表達分析實驗成敗的最關鍵因素之一，故維持RNA完整性並去除其中雜質是純化RNA 的關鍵。
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當前面的樣本破碎都準備就緒後，如何將完整釋放的RNA純化出來？目前常用的傳統方法是異硫氰酸胍-苯酚法提取RNA，其中常用到的是TRIxxL試劑，該試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，用來裂解細胞並釋放RNA。當加入氯仿並離心後可形成水相層和有機層水相層主要為RNA，有機層主要為DNA和蛋白質。在此過程中存在的問題是:
TRIxxL中的苯酚具有腐蝕性且有刺激性氣味，氯仿屬於二類易制毒化學品有刺激性氣味，務必避免實驗人員與有毒試劑的直接接觸。 RNA的回收率較低，容易有DNA或有機溶劑的污染。 由於操作不當，容易造成RNA降解，特別是胰臟等含RNase較多的樣本。 由於操作體系不同，不同實驗人員操作重複性差，很難進行微量化的操作。
QIAGEN 推出全面的RNA 純化專用方案擁有30 多年使用離心管柱純化核酸的經驗，使用專用裂解和洗滌緩衝液以及經過驗證的矽膠膜技術，有效解決樣本破碎問題，避免使用有毒試劑，保證RNA完整性和純度。
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矽膠膜技術原理
矽膠膜的核心是：矽膠基質和Chaotropic Salt。高濃度Chaotropic Salt裂解緩衝液能夠裂解細胞讓細胞內物質釋放即在此過程中RNA被釋放出來。此後，在高濃度Chaotropic Salt、適當體積的乙醇和低pH條件下釋放的RNA 能夠結合到Si基質上，經過洗滌後，在利用低鹽和高pH條件下，將RNA從矽膠膜上沖洗下來。
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矽膠膜離心柱技術操作流程
- 裂解 – 樣品有效裂解釋放RNA，並使RNase 失活
- 結合 – 優化條件將所需的RNA 與矽膠膜結合
- 洗滌 – 清洗矽膠膜去除雜質
- 洗脫 – 從矽膠膜上釋放RNA，用於下游實驗
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RNA 純化試劑的優點:
- 高效去除雜質：去除了基因組DNA和其他雜質污染，適用於所有下游應用
- 針對性強：為各種樣品類型專門優化純化方法，特別是針對疑難樣本，如：FFPE組織切片、血清或血漿樣本、外泌體等
- RNA產率高
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RNeasy系列試劑
RNeasy系列試劑採用了上述特殊的高鹽緩衝液，使得大於200nt的RNA可以與試劑盒中的矽膠膜結合。
基於矽膠膜技術的RNeasy系列試劑盒針對不同樣本類型提供有專門的純化方案，尤其是提取難度較高的疑難樣本。以FFPE切片組織為例， RNeasy FFPE Kit提供特殊的裂解緩衝液和孵育條件來逆轉RNA crosslink和甲醛修飾，同時避免RNA 進一步降解，可有效釋放組織切片中的所有RNA。
在涉及多體組學平行分析的系統生物學等研究領域，需要從同一樣本甚至同一切片中純化出DNA、RNA和蛋白質，來實現資料的可靠關聯。AllPrep試劑盒提供簡單的操作方法，能夠讓DNA、RNA和蛋白分別在獨立的離心管中純化出來，達到從單個樣品中純化RNA 和DNA 或蛋白質的目的。該試劑盒還可與Allprotect TissueReagent 結合使用，可穩定DNA，RNA 和蛋白質，確保可靠的基因組學，轉錄組學和蛋白質組學分析
