RNA萃取攻略-EP3

首先，在進行組織勻漿和破碎中，如何避免RNAase降解RNA？針對外源性RNase，RNA提取過程中所用到槍頭、EP管、勻漿器的鑽頭等器材使用0.1%DEPC水過夜浸泡，再經過高溫高壓滅菌及烘乾。當然，有條件的話，還是建議採用專用於RNA實驗的無RNase一次性耗材，不僅更加安全便捷，也能防止DEPC殘留對部分下游敏感應用的影響。RNA提取的實驗室環境，保證是無RNase環境，即操作臺面或超淨工作臺是無RNase環境，佩帶口罩和及時更換手套。針對內源性RNase，不同的組織需要不同的破碎和勻漿方法，實現RNA完全釋放的同時也防止RNase對RNA的降解。

上圖對比了樣本分別在沒有勻漿、渦旋1min、使用QIAshredder及電動勻漿儀的條件下RNA的得率。可以看到，使用QIAshredder和使用電動勻漿儀提取的RNA得率相當。所以，QIAshredder可以代替注射器的抽吸，減少樣本的消耗，並防止樣本間的交叉污染，去除碎片及降低粘稠度。

表1中，我們針對不同的組織推薦了不同的破碎和勻漿方法，但傳統的破碎方法往往操作繁瑣且耗時較多，特別是面對樣本較多的時候。針對這一問題，QIAGEN提供快速有效的裂解和均質化方法。

動物組織如心臟、肌肉以及皮膚組織:

組織中含有豐富的收縮蛋白和結締組織，以及干擾RNA分離的膠原蛋白

• 對於含有豐富的收縮蛋白和結締組織，組織細胞密度低，其中RNA含量較少，可以適當增加材料的起始用量。
• 務必要在低溫冷凍條件下將組織徹底磨碎，並儘量儘快研磨成粉末狀。
• 用蛋白酶或含有苯酚的試劑處理樣本。

胰腺樣本

該類樣本中RNase含量很高，提取過程中很容易發生RNA的降解。

• 儘量使用新鮮組織，採樣不宜太大，盡可能縮短樣本採集和快速冷凍的時間。
• 即時加入RNA穩定劑，使組織內的RNase失活及保護組織中的RNA。
• 快速勻漿，加入裂解液若粘稠至不能有效分層，可繼續加入更多裂解液。
• 採用RNeasy Mini Kit（貨號：74104）提取時，可將緩衝液RLT中加入的巰基乙醇含量提高至3-5%，能夠有效改善結果。

血液樣本

提取得到的RNA量少；由於RNase得到的RNA完整性較差，有降解；污染物包括抗凝劑-肝素和EDTA，以及天然酶抑制劑影響下游RNA分析實驗。

• 血液越新鮮越好，在血液收集管中使用RNA穩定試劑來保存RNA。
• 血液 RNA 提取本質上是白細胞RNA提取，使用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法回收單核細胞。
• 去除抗凝劑和酶抑制劑。
• 可採用專門用於血液樣本的RNA提取試劑盒（如：QIAamp RNA Blood Mini Kit，貨號：52304），其中含有高效的紅細胞裂解液，在有效裂解細胞的同時也能防止其中釋放出的大量RNase對後續RNA提取的影響。

FFPE樣本

FFPE樣本中的核酸在進⼊福馬林浸泡之前就開始發⽣降解；樣品基質內核酸易發⽣⽚段化、核苷酸堿基修飾以及核酸與蛋⽩的交聯。

• 使用厚度不超過5 mm的組織樣本，組織固定前的操作時間應當越短越好，避免RNA降解。
• 不要過度固定（最多24小時），固定時間越長，交聯程度越⼤，樣本中的RNA降解越厲害。
• 推薦使⽤中性的福馬林緩衝溶液及優質試劑進行石蠟包埋，不含添加劑。
• 盡可能避免樣品染色。
• 可考慮使用專門的環保型脫蠟液，降低對實驗環境的要求，簡化加速實驗流程，同時結合高效的交聯逆轉步驟，提高核酸的回收效率與品質。

 病毒樣本

• 盡可能使用新鮮的樣本，或凍融次數不超過一次，多次反復凍融會導致病毒載量下降。
• 在分離RNA之前，通過超速離心、超濾或沉澱濃縮病毒顆粒。
• 在RNA純化時添加載體RNA，如QIAGEN Carrier RNA（貨號：1068337）

  細菌樣本

高度不穩定，mRNA很容易快速降解

• 樣本採集時，加入RNA穩定劑，立即使RNase失活和穩定及保護組織中的RNA。
• 可考慮採用更為快速的研磨方案，降低研磨過程中產生的大量熱量對RNA降解的加速，如PowerLyzer 24結合特定的珠磨研磨技術。