RNA萃取攻略-EP1

RNA萃取容易被忽略的種類?

血液樣本由於其易於收集，傷害性小的特點而被廣泛用於臨床研究。在腫瘤等疾病的早篩研究中，RNA等生物標誌物彌補了傳統的影像學、生化指標方法的缺陷而備受關注。由於血液樣本的特殊性以及RNA分子本身容易降解的不穩定性，更容易受到來自紅細胞等多種來源RNase的影響。因此，針對血液樣本中RNA的萃取，除了需要能夠從血液樣本中成功對RNA進行分離外，也更加需要保障RNA分子不受降解。另外，血液採集後由於基因誘導、細胞凋亡的發生，使得血液中核酸的組成、數量、品質和完整性在幾分鐘內發生顯著變化。

因此想要獲得與體內基因表達一致並具備高品質的RNA，從血液樣本的採集到血液樣本RNA的穩定和保護，每一環節都面臨挑戰。

採集血液時，如何盡可能避免發生溶血?

  • 避免長時間使用止血帶或握拳
  • 避免從血腫處抽血，避免樣本起泡
  • 確保靜脈穿刺部位乾燥，避免探查性、創傷性靜脈穿刺
  • 使用正確尺寸的針(~22號)，採血時完全填充真空採血管

根據不同的應用所需的RNA血液萃取分為兩大類：

血液樣本中RNA萃取: 

血液中包含紅血球、白血球及血小板等，哺乳動物成熟的紅血球和血小板是無核的，在進行血液胞內RNA萃取時，其RNA主要來自於白血球。由於全血樣本含有大量紅血球，而紅血球中含有大量的RNase，因此在萃取RNA之前通常需要先去除紅細胞。去除紅血球的方式有兩種，一種為通過離心的方式獲得白血球，進而進行白血球（淋巴細胞、單核細胞和粒細胞）RNA萃取；另外一種方式為先使用紅血球裂解液（如Buffer EL）去除紅血球，再進行白血球RNA萃取。

無論哪種萃取方式，血液採集後由於RNA的表達譜短時間內會發生改變，建議儘快開展RNA萃取實驗

若血液採集後無法立即開展實驗，建議使用血液RNA穩定管-PAXgene Blood RNA Tube進行血液的採集和RNA的穩定，後續使用配套的PAXgene Blood RNA Kit進行血液RNA萃取，下圖顯示使用PAXgene Blood RNA system，在18-25°C下長達3天或在2-8°C下長達5天內血液RNA一直穩定。

若使用EDTA和檸檬酸鹽抗凝管進行血液採集（注：避免使用肝素抗凝管，因肝素較難去除，且會干擾基於酶試劑的下游應用）。為了保證得到最佳結果，血液採集後應該應儘快進行處理並完成RNA萃取，不應進行長時間儲存。如下圖所示，有研究發現在EDTA管中儲存的血液樣本中，p53基因的轉錄本在採樣1日時檢測信號很弱，表明血液中RNA已經重度降解[1]。

酚-氯仿方法是血液樣本中RNA萃取常用的方法之一。有研究人員通過對比酚-氯仿的方法和PAXgene RNA Kit，發現雖然使用酚-氯仿的方法RNA的得率較高，但RNA的完整性及後續檢測實驗的靈敏性大打折扣[2]。

透過qPCR實驗檢測發現，使用TRI reagent得到的RNA在後續的檢測實驗中，內參基因的表達明顯處於較低水準，不具有參考意義。使用PAXgene Blood RNA system得到的RNA完整性高且在後續的qPCR檢測中，表現出較高的靈敏性。其中，使用PAXgene Blood RNA system只需要室溫孵育，不再需要額外的紅血球裂解步驟，簡化RNA萃取操作流程。

此外，對於採集在EDTA等血液採集管中的新鮮血液，如果能夠及時進行RNA萃取實驗，則推薦使用QIAamp RNA Blood Kit進行全血RNA的萃取。該試劑盒基於矽膠膜柱法無需離心分離白膜層等步驟，可直接對最高1.5 ml的全血樣本進行RNA萃取。除QIAamp矽膠膜柱外，試劑盒中還包含一款特殊的QIAshredder離心柱，基於獨特的生物聚合物剪切體系，用於去除樣本中的細胞碎片等雜質，降低樣本粘稠度，從而實現更好的均質化，提高RNA得率。下圖顯示了使用QIAamp RNA Blood Kit對使用不同採

血管採樣的健康人全血樣本進行RNA萃取，得到的RNA 28S與18S比例在合理範圍內，證明RNA完整性高。

另外，如果在採集血液樣本後已經分離好了白膜層，針對白膜層RNA的萃取，可使用RNeasy Mini Kit進行RNA萃取，並用於後續的實驗分析[3]。

除了以上全血RNA萃取的建議和方案，在血液RNA研究中一些游離非編碼RNA發揮著顯著的調控作用，特別是在腫瘤等疾病的早篩研究中，miRNA因其在血液中的高穩定性和檢測的便捷性，被認為是理想的液體活檢標誌物而備受關注。針對分離了血細胞後的血清或血漿樣本中游離RNA的萃取，通常需要採用專門的萃取方案樣本處理的方法及注意事項也有所不同。

血液游離RNA萃取-血漿/血清RNA萃取

針對血液游離RNA萃取，QIAGEN的miRNeasy系列可實現從血清/血漿樣本中進行包括miRNA在內的總RNA萃取。在RNA萃取之前需要注意的是在血液採集後依然需要進行RNA的穩定和保護。因此，建議採樣1小時內完成血漿或血清的分離，避免發生溶血。如果分離得到血清/血漿樣本後依然沒辦法立即開展實驗，則需要凍存。凍存前建議將血清或血漿3000 x g 離心5-15分鐘，或使用0.8 μm篩檢程式去除殘留的細胞和碎片，避免殘留的細胞破裂釋放RNA到體液中。如果不能立即清除細胞碎片，樣本可在2-8°C下保存最多24小時。另外，如需從血清/血漿的細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）進行RNA萃取，推薦使用exoRNeasy Midi/Maxi Kits，該系列試劑盒將基於膜親和技術的exoEasy EV分離方案和經典的矽膠膜技術完美結合，可實現從EV中得到高品質的總RNA。

除手工方法外QIAGEN還可提供多款基於QIAsymphony等自動化平臺的血液RNA萃取方案，全面滿足RNA萃取實驗的自動化、高通量等複雜要求。

参考文獻：
1.Rainen L, Oelmueller U, Jurgensen S, et al. Stabilization of mRNA expression in whole blood samples[J]. Clinical chemistry, 2002, 48(11): 1883-1890.
2.Kim J H, Jin H O, Park J A, et al. Comparison of three different kits for extraction of high-quality RNA from frozen blood[J]. Springerplus, 2014, 3: 1-5.
3.Feezor R J, Baker H V, Mindrinos M, et al. Whole blood and leukocyte RNA isolation for gene expression analyses[J]. Physiological genomics, 2004, 19(3): 247-254.！
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