QIAGEN經典游離核酸萃取試劑盒，包括QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit   (#55114)、QIAamp ccfDNA/RNA Kit (#55184) 等方案，均能萃取到cfDNA和cfRNA兩種核酸。開展cfDNA+cfRNA多組學分析不需要額外的樣本與純化步驟，那麼cfRNA的含量有多少呢？

為了評估並區分cfDNA與cfRNA的萃取效率，來自比利時根特腫瘤研究所的研究人員開發了一種基於dPCR的評估方法，成果發表在Human Genomics上[1]。研究人員選擇了4個在血液中高表達的基因，在其中一個外顯子上設計引物探針，確保同一擴增體系可以同時用於cfDNA與cfRNA檢測以降低誤差，同時用鎖核酸（LNA）標記探針以提高特異性與靈敏度。

文章對比了不同萃取方案獲得的cfDNA以及cfRNA的拷貝數，QIAGEN經典手抽試劑（圖中CCF1/4）在相同起始樣本量的對比中產量均名列前茅，並且總體上看cfRNA的copy數遠高於cfDNA。CAT (iCatcher) 方案的核酸產量雖高，但在進行多個樣本測試後發現穩定性和重複性不足，仍不推薦用於後續實驗。

樣本分成兩份分別進行cfDNA和cfRNA定量的實驗方式不同，研究人員隨後對萃取得到的總核酸直接進行了定量分析。結果顯示得到的總拷貝數顯著高於單獨測量的cfDNA與cfRNA copy數之和，遠超預期。猜測有兩個可能原因：一是cfRNA純化過程需要使用DNase處理，這個步驟可能一定程度造成cfRNA的損傷或損失；二是cDNA合成步驟一定程度會提高cfDNA的品質。結果上看cfDNA和cfRNA同時分析可以顯著提高檢測的靈敏度。

cfRNA包括mRNA、lncRNA、miRNA等，其中的miRNA由於長度較短且含量較低，無論提萃取還是定量都面臨一定的挑戰，而其攜帶的豐富基因資訊卻是多組學研究的重要拼圖[2-3]。QIAGEN的miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (#217204) 可從200 μl或更高體積的血漿/血清樣本中高效純化包括miRNA在內的游離RNA，優化的無毒環保型裂解液也能對囊泡進行有效裂解，從而純化囊泡內外的RNA。本研究也對這一試劑盒萃取的cfRNA進行了研究（圖中的mRNA），分別針對0.06/0.2/0.6 ml起始樣本進行了cfRNA萃取，結果顯示在樣本量受限的情況下，miRNeasy試劑盒依然可以實現超高的cfRNA回收率。

miRNA的定量研究人員普遍會面臨以下難題：

• miRNA序列短，很難正常設計qPCR上下游引物
• miRNA序列高度同源，許多miRNA間只差一個鹼基
• miRNA GC含量差別大（20—95%），擴增效率難以兼顧
• miRNA表達量差別大，低表現量miRNA 難以檢測

QIAGEN的解決方案與本研究使用的方法相同——即基於強大的LNA技術，克服全部挑戰！

LNA是將寡核苷酸序列中的β-D-呋喃核糖的2’-O，4’-C位通過縮水形成的剛性結構，增加引物和探針的Tm值，從而實現更短的引物和探針設計。在檢測稀有突變時，由於樣本濃度低並且在突變前後整個目標分子的序列可能僅有單個鹼基的差別，通過鎖核酸修飾的探針和引物增強了對互補序列的親和力和特異性。

QIAGEN基於LNA技術設計推出的miRCURY LNA miRNA qPCR系統，使用加尾法實現miRNA的高通量反轉錄，SYBR GREEN和Taqman雙系統，可實現低至1 pg totalRNA的起始樣本或單拷貝目標miRNA的高靈敏、特異性的定量。提供多個物種中大量miRNA的predesignassay，並可客製用於qPCR或dPCR平臺的檢測。除用於單個檢測的assay產品外，還可將多個目標客製化在一塊96、384孔盤上，實現更加靈活、更高通量的檢測。

同時QIAGEN在QIAcuity dPCR上已開發並驗證了針對常見突變位點檢測的250組dPCR LNA Mutation Assay。經過鎖核酸修飾的LNA Mutation Assay結合QIAcuity數位PCR平臺可以在野生型基因組背景下檢測到低於0.1%的突變體，尤其適合游離核酸中的低頻突變檢測。