RNA萃取攻略-EP2


RNA萃取攻略之樣本採集

1868年，瑞士生物學家 Friedrich Miescher在細胞核中發現核酸，從此開啟了RNA的探索之路。迄今為止，在活細胞中總共發現了至少14種RNA，典型的單個快速生長哺乳動物細胞中含有10–30pg總RNA，而完全分化的原代細胞RNA含量則更少，僅約含1pg。其中，最為大家熟知的RNA有mRNA、rRNA、tRNA以及其他非編碼RNA如lncRNA、snoRNA、miRNA、siRNA和piRNA等。儘管不同類型中RNA的占比取決於細胞類型和生理狀態，但占比最多的RNA分子還是tRNA和rRNA，mRNA僅占細胞總RNA 的約3–7％。無論是作為功能基因研究的mRNA還是具有調控功能的miRNA，對RNA的表達進行分析在很多情況下都是進一步進行其他研究的基礎。目前常用的RNA分子生物學分析方法有qPCR、NGS測序等，無論採用哪種方法，結果的可靠性很大程度取決於所用RNA樣品的品質。因此，RNA樣本製備是下游分析實驗成功的基礎。

哺乳動物中 RNA組成 

如何採集樣本才能獲得高品質的RNA?

想要獲得高品質的RNA，樣本該如何採集？無論是動植物樣本還是其他樣本，在處理和收集樣本時，細胞中的RNA表達普通常會發生改變，即基因會在組織離體狀態下會發生表達的上調或下調）。另外，細胞內的RNA酶對RNA的降解也會在此期間發生，而同時啟動的細胞凋亡程式也可能導致RNA轉錄水準的變化。

因此，在收集用於RNA提取的樣本，即在新鮮的組織在離開活體或者原本的生長環境時，通常需要立即並快速的將樣本放入液氮中冷凍，或者後續長期在-80℃中保存。但樣本中存在的內源性RNA酶在離開活體時即會開始降解RNA，且在後續樣本破碎勻漿釋放RNA的過程中同樣也會發生內源性RNA酶對RNA的降解。所以，在樣本採集時需要儘量使用RNA穩定保護劑，例如組織樣本在採集後，可立即浸泡在適當體積的RNAprotect組織保護試劑中，從一開始就對樣本進行保護。另外，在沒有液氮時，如在野外進行樣本採集時，同樣可以使用相關RNA穩定保護劑，該操作只需在室溫下操作便可以輕鬆、安全地穩定和保護樣本中的RNA。

從經過穩定的樣本中純化得到未降解的RNA(獲取大鼠腎臟後立即在RNAprotect Tissue Reagent中穩定或不進行穩定，0–60分鐘後分階段從穩定處理組和未穩定處理組的樣本中純化RNA並進行瓊脂糖凝膠電泳和Northern blot分析。)

QIAGEN RNA 穩定技術可實現下列優點:

  • 即時穩定RNA
  • 室溫下操作，簡便、快捷；無需使用液氮或乾冰冷凍樣品
  • 運輸和儲存過程中，溫度對細胞內RNA表達和RNA 完整性無影響
  • 存儲時間長，無RNA 降解

QIAGEN RNA 穩定技術在組織和細菌樣本保存的表現

下圖表示了從儲存在RNAprotect Tissue Reagent中的組織樣本中提取總RNA。[A]在指定條件下保存的大鼠肺組織，分別通過瓊脂糖凝膠電泳和Northern blot（GAPDH探針)分析RNA。[B]小鼠肝組織進行反復凍融迴圈 (-20°C/25°C)。C為對照組織，立即冷凍於液氮並後續在-80°C保存從A和B的結果可以得出，儲存在RNAprotect Tissue Reagent中的組織樣本在不同的溫度及反復凍融的條件下純化得到的RNA具有較高的完整性。

組織中RNA穩定: 不同的儲存溫度和反復凍融

在下圖的實驗中，為了監測mRNA的降解，向生長的大腸桿菌培養物中添加RNA聚合酶抑制劑利福平來終止轉錄。隨後將培養物等分成兩半，並將RNAprotect Bacteria Reagent加入其中的一半培養物中。在進行離心和RNA純化之前，樣品在室溫下分別放置0、4、8和16分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳分析所得RNA（圖5中上圖）。通過Northern blot檢測具有不同半衰期的兩個標記基因的表達，分別得到中圖ompA基因（半衰期為15分鐘）和下圖bla基因（半衰期為2-5分鐘）的Northern blot結果。該實驗結果表明，向細菌培養物中加入RNAprotect Bacteria Reagent能夠有效的防止RNA降解，保持RNA的完整性且穩定時間可以持續長達16min。

RNAprotect Bacteria Reagent 能夠有效防止mRNA降解

QIAGEN RNA穩定技術在動物全血樣本保存的表現

研發人員分別使用RNAprotect Animal Blood Tubes和EDTA采血管收集來自同一只大鼠的血樣 (500μl)，並將收集的樣品在15–25℃下儲存0分鐘 (t=0) 至6小時，並隨後使用RNeasy試劑盒純化RNA後通過定量PCR來分析FOS表達量。Y軸上的ΔCT表示t=0樣本時的CT值減去當下時間的CT值。該實驗表明，在使用RNAprotect Animal Blood Tubes穩定的樣品中，FOS基因表達保持穩定，但在EDTA管保存的樣品中FOS的表達情況會隨著時間延長而發生變化（在其他大鼠中觀察到相同的結果；資料未顯示）。

轉錄得到有效穩定

同樣，在採用分光光度計法對從4只大鼠通過使用RNAprotect Animial Blood Tubes收集的血液樣本中的RNA品質進行測定後可看到，不僅RNA產量穩定，且來自同一大鼠的不同血樣RNA得率 (%CV) 的差異性僅在2.4%-5.9%之間。

RNA高得率的可重複性

除上述主要RNA樣品採集和穩定產品外，QIAGEN還可提供針對多種樣本類型及應用的相關產品，如下所示：

以上便是獲得高品質RNA需要注意的樣本採集特別事項以及相關產品的選擇指南，希望可以為您的研究或實驗工作帶來幫助。那麼作為RNA萃取實驗的開端— “樣本破碎”又有哪些注意事項？不同的樣本分別適合的破碎方法有哪些？

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